基因測序儀四十年：回顧、致敬與展望

基因測序儀四十年：回顧、致敬與展望

  (2018-09-08 10:53:44)

轉載▼

 

華大基因（BGI）於1999年9月9日因成承擔1%人類基因組計劃而成立，即將迎來19歲生日。

當初，促使其成立的人類基因組計劃（HGP），已於2003年正式宣告完成。做爲20世紀影響最大的天然科學研究計劃之一，人類基因組計劃其影響仍在繼續。基因組學已經發展成爲一門科學，咱們開始從全基因組規模、核苷酸水平的全新廣度與深度來研究生物科學。

工欲善其事、必先利其器。DNA測序是基因組學的核心技術，也是現代生命科學應用最普遍的技術之一。1977年，沃特·吉爾伯特（Walter Gilbert）等在PNAS上發表了化學降解測序法。同一年，弗雷德裏克·桑格（Frederick Sanger）也在PNAS上發表了雙脫氧核苷酸末段終止法（該方法後來成爲當DNA測序的首選技術，被稱爲Sanger 測序）、並在當年解析了噬菌體 ϕX174的全基因組序列（這也是人類解讀的第一個完整的生物的基因組全序列）。此後，在HGP、基因組學以及其餘「組學」推進下，測序技術獲得了突飛猛進的發展。

基因測序儀不只用於科研，也正在成爲精準醫學的重要工具（一些測序儀已經進入臨牀，參見文後附表）。現在，藉助一臺NGS測序儀，幾名稍有基礎的醫學檢驗人員，即可在幾天時間內完成一個孕婦的無創產前檢測（NIPT）。

在測序技術與工具不斷推陳出新的同時，測序儀公司也在這一波波的浪潮中經歷發展與變遷，其中一些與時俱進並日益壯大，另外一些在經歷短暫輝煌後漸行漸遠、乃至消聲匿跡，與此同時，一些新成員也在陸續加入，爲行業帶來新的思路與活力。

在華大成立19年之際，想聊聊那些咱們曾經打過交道的測序儀公司、使用過的測序儀，這其中也貫穿着基因測序技術發展的大體脈絡。此次不談技術，只回顧往事，致敬前人並展望將來。

 

1、ABI 、Life Technologies 、Thermo Fisher Scientific

      主要標籤：第一臺商品化的平板電泳全自動測序儀、毛細管凝膠電泳測序儀、人類基因組測定、NGS測序儀、量產臨牀級別測序儀

上世紀80年代早期，加州理工學院的Leroy Hood（4P醫學的創導者）發明了四色熒光標記，使得一條電泳道能夠分析一個標本的四種測序反應產物，顯著提升了測序反應效率。基於這一技術，美國應用生物系統公司（Applied biosystems Inc，簡稱ABI，成立於1981年）於1986年推出了第一臺商品化的平板電泳全自動測序儀ABI 370A。如今來看，當時的「全自動」實際上是半自動，由於測序的主要步驟如制膠與加樣，還須要手工完成。

隨後，ABI開發了毛細管凝膠電泳技術，並於90年代早期推出了ABI Prism 3十、3100等機型。1998年，其推出的ABI Prism 3700毛細管測序儀則真正實現了測序規模化。2000年，著名學者Craig Wenter利用這一平臺獨立完成了人力基因組的測定，ABI所以名聲大噪。此後，在ABI 3700基礎上的發展出3730，至今還是一代測序的主力機型，也是用於驗證其餘新測序設備所發現變異是否準確的金標準。

2000年後，大規模並行測序技術使測序進入高通量時代，NGS新一代測序系統問世了。在NGS問世初期，ABI推出的SOLiD 曾一度與45四、 Solexa/ Illumina 造成三足鼎立的局面。SOLiD所採用的是基於DNA鏈接反應的測序，因爲技術複雜、測序穩定性不佳等因素，已經停產。

2008年， ABI 與Invitrogen合併，成立了Life Technologies。後者在2010年、2012年推出了半導體測序儀Ion Torrent和Ion Proton，取得了不錯的效果，算是在NGS競爭中扳回一局。

2014年，Life Technologies 又被 Thermo Fisher Scientific Corporation（賽默飛世爾） 以136億美圓收購。Thermo Fisher Scientific能夠量產臨牀級別的測序儀。目前，在我國取得醫療器械資質的基因測序儀中，就有基於Ion Proton的測序平臺（見附表一、2）。

 

2、Molecular Dynamics 、Pharmacia /Amersham 、GE

      主要標籤：第一代自動化測序儀、毛細管電泳測序儀、人類基因組測定

人類基因組計劃（HGP）主要的測序工做，除了ABI 3700型測序儀，還有美國Molecular Dynamics 公司於1997年推出的測序儀MegaBACE1000。這款測序儀與ABI 3700在原理、自動化程度和通量方面都比較類似，但性價比更高，是人類基因組計劃成功實施的重要機型。

1998年，Molecular Dynamics被英國公司安瑪西亞（Amersham）收購。2004年，後者又被美國通用電氣公司（GE）收購，成爲GE醫療集團的一部分。期間，MegaBACE型號由1000升級爲4000，毛細管數量增長到了384道，隨後推出了略有改進的4500 。在與ABI的競爭中，MegaBACE測序儀後勁不足，已經謝幕。

一些朋友可能還記得法瑪西亞（Pharmacia）這家公司。1997年，這家瑞典公司與安瑪西亞合併，更名爲安瑪西亞-法瑪西亞生物技術公司。法瑪西亞這個名字在2001年以後再也不使用。在ABI推出第一臺平板電泳全自動測序儀的同時期，Pharmacia 也推出過第一代自動化測序儀ALF（全自動激光熒光DNA測序系統），由歐洲分子生物學實驗室（EMBL）的Wilhelm Ansorge發明。

 

 

3、454 Life Sciences 與Roche

      主要標籤：第一個商品化的NGS平臺

454 生命科學公司（454 Life Sciences ，隸屬於CuraGen集團）於2005年推出的GS20測序儀，是第一個商品化的NGS平臺，其測序反應採用的是焦磷酸測序法。454是當時在CuraGen的項目代碼，數字自己並沒有實際意義。

454測序儀在剛剛問世時，勢頭強勁，2005年曾得到華爾街雜誌當年的生物技術醫藥類的創新金獎。

2007年3月，有着百年曆史的老牌公司羅氏（Hoffmann-La Roche）旗下的羅氏診斷（Roche Diagnostics）以1.55億美圓收購了454 生命科學公司。同年5月，454 發表了DNA雙螺旋結果發現人之一的James Watson的我的基因組測序結果。儘管生而燦爛，後又邁入豪門，因爲在454測序系統在通量、準確性、以及成本等方面缺少競爭力，羅氏於2013年關閉454的測序業務， 454測序儀於2016年退出測序舞臺。

這並不意味着羅氏將放棄測序儀領域。2013年，羅氏診斷與單分子測序公司PacBio與達成合做意向，不過這一合做已於2017年初終止。2014年，羅氏收購了納米孔測序公司Genia Technologies。考慮到羅氏自身在分子診斷以及測序解決方案領域已積累的不俗實力，將來在測序儀領域或可捲土重來。

 

4、Lynx、Solexa與Illumina

      主要標籤：最爲成功的NGS公司、可量產臨牀級別測序儀

Solexa與Illumina 均成立於1998年。Solexa公司採用可逆末端終止法進行固相邊合成邊測序的技術來自劍橋大學。2005年，Solexa反向收購Lynx Therapeutics，並藉助其能力將其技術轉化爲商業化測序儀。2007年，Illumina完成了對 Solexa的收購，進入基因組測序儀研發製造領域，並憑藉其測序系統的出色性能 ，在NGS之爭中完勝ABI和454，成爲最爲強勁的成員。

Solexa/Illumina的第一代測序儀Genome Analyzer，於2006年面世，可以在單次運行內測序1 Gb的數據。在隨後的幾年中，Illumina陸續推出了HiSeq、MiSeq、MiniSeq、NextSeq以及適用於超大規模測序的HiSeq X Ten、NovaSeq等系列機型，以知足不一樣測序規模與應用的需求。

相比前幾家公司，Illumina的測序儀業務並非最先開展的，但其在基因組領域也絕非新面孔。早期的微珠芯片SNP基因分型系統曾在HapMap 計劃中受到歡迎，北京華大在HapMap 中國卷工做中就使用過這一系統。通過自身技術積累與商業收購，這家美國公司目前已經成爲基因組技術領域最爲重要提供者，佔據了全球測序儀器市場超過70%的份額。

2010年後，Illumina在臨牀診斷領域日漸活躍，目前的實力可量產臨牀級別的測序儀。2013年，Illumina 收購了NIPT公司Verinata Health，增強其在生育健康領域的能力佈局。2015年，又將Grail剝離出來，以聚焦於癌症血液檢測。這些臨牀檢測無疑都將使用Illumina測序儀。這家公司的MiSeqDx測序儀也已得到我國進口醫療器械的文號。此外，我國有幾款取得醫療器械資質的基因測序儀中，就有基於Illumina測序儀的產品，儘管如此，仍屬於國產醫療器械。

 

 

5、華大基因（BGI）與華大智造（MGI）

      主要標籤：從基因組研究拓展到自主化測序儀研發製造、可量產臨牀級別測序儀

華大基因於1999年因人類基因組計劃而成立，此後一直致力於人類、動植物、微生物基因組測序與研究，參與、發起了很多有影響力的基因組項目。

在早期基因組項目中，做爲基因組研究核心工具的基因測序儀，卻只能依賴進口，不只設備投入大，試劑耗材費用高、後續維護更加使人頭痛。擁有自主可控的核心工具和平臺，擁有立足於基因組領域領先位置的核心競爭力，也就成爲華大智造的重要目標。華大在2013年收購美國上市公司Complete Genomics（簡稱CG），獲取了核心技術，並以此爲契機研發製造自主可控的全貫穿組學技術平臺，測序儀其重要內容。

2014年6月30日，CFDA批准了主要用於檢測胎兒染色體非整倍體首個NGS 測序儀就來自華大。通過幾年努力，華大智造陸續推出了幾款新的NGS儀與配套設備，其中BGISEQ-50、MGISEQ-200以及MGISEQ-2000，已經得到醫療器械註冊許可，與CFDA批准的體外診斷試劑及軟件配合用於臨牀檢測。

 

6、新型測序儀表明：Helicos BioSciences、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies

測序技術發展並未定下腳步，納米、芯片、微流控、光電、生化、計算機、精密加工等相關技術的發展，給測序技術帶來新動力與新思路。部分新型技術已開始商業化推廣，但尚達到NGS那樣的規模，放在一塊兒簡要回顧下。

 （1）Helicos BioSciences： 第一臺真正的單分子測序儀

這家美國公司成立於2003年，其在2008年推出的HeliScope，能夠說是在測序歷史上第一臺真正的單分子測序儀。該系統採用超敏感熒光檢測，再也不依賴擴增獲得的分子簇來加強信號，但本質上仍是基於合成的測序。2009年，斯坦福大學Stephen Quake（Helicos技術開發者與公司創始人之一），採用該測序儀完成了自身基因組的測序。相比已有技術，HeliScope的讀長、通量和成本都不佔顯著優點。2012年末，Helicos正式提出申請破產保護。

（2）Pacific Biosciences（PacBio）：首個單分子實時測序系統

PacBio 於2004年成立， 推出了第一個實際應用單分子實時測序技術（SMRT）的測序系統，在合成反應過程當中直接區別每一個整合到新鏈上的熒光信號，而非在每一次合成反應的終點再進行檢測。PacBio於2011年推出了第一個商業化設備PacBio RS，2013年推出升級版PacBio RS II，其在2015年推出Sequel，讀長較RSII有了顯著提高，雖存在較高的錯誤率，依然成爲市場上三代測序最爲主力的機型。

PacBio已開始嘗試醫學應用，在傳染病疫情的病原體鑑定方面還有過兩篇NEJM論文。2013年，PacBio與羅氏診斷達成意向，利用其SMRT技術開發診斷用的測序系統，不過這一合做已於2017年初終止。2014年，PacBio與荷蘭分子診斷公司GenDx 合做，提供HLA測序服務。美國HudsonAlpha 生物技術研究所今年也將利用SEQUEL測序平臺，用於NIH資助的兒童發育異常的研究與診斷工做。

  （3）Oxford Nanopore Technologies：納米孔測序、迷你測序儀

納米孔技術被認爲是測序技術的發展方向，主要根據核酸鏈模板分子經過納米孔引發的信號變化進行實時測序，速度快、成本低。英國公司Oxford Nanopore成立於2005年，於2012年推出應用基於納米孔技術的迷你型測序儀MinION（僅U盤大小，產量在40Gb左右，每秒可讀取500個鹼基），因其小巧的設計與便捷的操做，成功引發市場關注。

2016年，美國宇航員在國際空間站內利用MinION成功完成微重力條件下的DNA測序，這是MinION 最爲人津津樂道的應用案例。在臨牀方面，已經有學者開始應用MinION進行無創產前檢測的可行性研究。

 

7、小結

從上世紀70年代測序技術的發明，到80年代Sanger測序儀的問世、新世紀高通量測序儀的日漸普及、新型單分子測序儀的相繼推出，測序技術與工具發展跨越四十餘年時間，也映射出基因組學科與基因產業的發展歷程。

風物長宜放眼量。在人類基因組計劃框架圖完成後，國際基因組科學家提出了在當時看來高不可攀的目標，即一千美圓完成一我的類基因組測序。由於只有這樣，測序技術纔可以掃清經濟上的障礙而服務醫學健康、服務大衆。今年一月份，華大基於自主測序平臺BGISEQ-500，以600美圓價格引領我的全基因組測序進入百元美圓時代。在臨牀應用領域，華大智造躋身全球三家能夠量產臨牀級別測序儀的公司之一，另外兩家分別是來自美國的Illumina 與 Thermo Fisher Scientific。這反映了本土機構從依靠採購進口儀器設備，到自主開發儀器設備，創新科技範式，創建國際標準的發展路徑。核心工具自主化，不只有助於推進我國率先進入千元基因組時代，更能夠爲自身科研與醫學應用保駕護航，造成長期可持續發展的優點。

 

 

 

 

主要參考資料：

1.       基因組學.楊煥明.北京：科學出版社,2016.10.  ISBN: 978-7-03-049902-8

2.       Ansorge WJ. Next-generation DNA sequencing techniques. N Biotechnol. 2009 Apr;25(4):195-203.

3.       Sanger F. et al. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463–5467.

4.       Maxam, A.M. and Gilbert, W. (1977) A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 560–564.

5.       Sanger F, et al. Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA. Nature. 1977 Feb 24;265(5596):687-95.

6.       https://www.genome.gov/11008124/