生物標記鈣衛蛋白在RA診療中的應用研究

標籤: 類風溼關節炎; 預測因子; 鈣衛蛋白; S100A9

[文獻摘記]生物標記鈣衛蛋白在RA診療中的應用研究

電郵發佈日期:2016年4月20日

不斷提高精確度和應用範圍的組學技術正在幫助包括類風溼關節炎(RA)在內的自身免疫性疾病逐步接近理想的個體化治療。組學技術的突飛猛進，爲RA提供了不少候選生物標記，但因爲還未通過嚴格檢驗，因此目前幾乎沒有已投入常規臨牀應用且有明確的療效預測、療效監測或預後預測應用價值的生物標記。主要由粒細胞和單核細胞產生的鈣衛蛋白(calprotectin)是一種非疾病特異性的炎症相關蛋白，在關節炎的滑液以及外周血中高表達。目前已知鈣衛蛋白參與多種自身免疫性疾病的發病，近年研究又提示它對RA的預後以及藥物療效有預測做用。

1、簡述鈣衛蛋白

鈣衛蛋白是由鈣結合蛋白S100家族的S100A8和S100A9組成的異二聚體，高表達於粒細胞和單核細胞。因爲表達於髓系細胞，S100A8和S100A9又被分別稱爲髓相關蛋白MRP8和MRP14。鈣衛蛋白在炎症的發生局部被大量釋放。鈣衛蛋白做爲TLR-4配體參與多種自身免疫性疾病的發病,包括系統性紅斑狼瘡(SLE)、類風溼關節炎(RA)以及炎性腸病(IBD)等(1)。

2、英國Scott教授的一篇系統性綜述

英國倫敦國王學院醫學院David L Scott教授等學者於2015年發表一篇系統性綜述,彙總了鈣衛蛋白在類風溼關節炎（RA）診療中的應用研究進展(2)。研究者從發表於1988年至2013年期間的270篇相關文獻中遴選了17項符合預設條件的論文。這些研究的樣本量大多數較小（中位數43例，範圍：11-170例）。重要發現摘錄以下。

1. 外周血與滑液表達水平

（1）16項研究報道了鈣衛蛋白外周血表達水平，共計23種患者羣（n=1051）。RA患者表達水平高於對照組。血清與血漿表達水平無明顯差別。不一樣研究所報道的外周血表達水平有顯著差別。ELISA檢測法的批次內預期CV值一般爲5%，而實際觀察到鈣衛蛋白血漿檢測CV值範圍爲70%至超過200%，血清檢測CV值範圍爲15%至超過200%。研究者推測，除了不一樣研究所用ELISA檢測法有所不一樣，批次內的異質性最有可能反映不一樣患者表達水平的變異性，這可能提示了不一樣疾病活動度的差別。

（2）5項研究報道了鈣衛蛋白在關節滑液的表達水平，總計112例患者。不一樣研究之間以及同一研究內均有顯著的變異性，有的檢測CV值很高（超過400%），有的則較低（13%至59%）。有3項研究稱鈣衛蛋白滑液表達水平與外周血有顯著相關性，而在對照組的骨關節炎和脊柱關節炎患者中未見這種相關性。有4項研究都發現RA患者滑液鈣衛蛋白水平高於對照組骨關節炎。

2. 與臨牀和實驗室指標的相關性

（1）鈣衛蛋白外周血水平與常規實驗室指標的相關性一般高於與臨牀參數的相關性，其中相關性最高的是CRP（r=0.80）和ESR（r=0.70）。有一項涉及61例極早期關節炎患者的研究揭示鈣衛蛋白在1年內的平均水平與CRP、ESR、RF和抗CCP呈顯著相關性，校訂性別、年齡和病程後顯示鈣衛蛋白與IgM-RF和抗CCP顯著相關。但這種相關性未在另外一項樣本較小的研究中獲得驗證。

（2）RF陽性RA患者的鈣衛蛋白外周血水平高於RF陰性者。一項隨訪10年的研究顯示，IgM-RF、IgA-RF或抗CCP陽性者在基線和隨訪過程當中的鈣衛蛋白水平高於上述血清學指標陰性者。

（3）有2項研究顯示鈣衛蛋白表達水平與DAS28強相關（r=0.60，r=0.55）。另外一項研究發如今多個血清學指標中僅有鈣衛蛋白與SJC（r=0.24）、握力（r=-0.22）、PIP周長（r=0.33）以及病情全面評估（r=0.24）有顯著相關性，而未發現CRP、ESR和RF各自單獨與這些臨牀指標的相關性。

（4）一項涉及145例RA患者的橫斷面分析顯示鈣衛蛋白與van der Heijde改良Sharp評分（mTSS）以及類風溼關節炎關節損傷評分（RAAD）有顯著相關性，這種相關性卻未見於CRP或ESR。

3. 鈣衛蛋白對治療的反應以及對療效與預後的預測做用

（1）一項針對124例RA患者的10年隨訪研究顯示鈣衛蛋白與RA關節損傷進展有相關性。在校訂性別、CRP、ESR和抗CCP以後,多元迴歸分析顯示基線鈣衛蛋白水平仍與Sharp總評分自基線進展以及RAAD分值之間有顯著相關性。而另外一項56例患者的5年前瞻性隨訪研究並未發現鈣衛蛋白對放射學進展(Larsen評分)有預測做用，但綜述者注意到這組患者病程較長（中位數7.8年），可能會帶來放射學進展較少的偏倚。

（2）一項20例患者接受TNFi治療1年的隨訪研究揭示，在臨牀和實驗室指標中，鈣衛蛋白獨立與關節超聲總評分相關，並且對治療反應的變化也高於CRP、ESR和血清澱粉樣蛋白A。

（3）該綜述羅列5項研究揭示鈣衛蛋白對藥物治療的反應(表1)，治療藥物既有傳統DMARD，也有生物製劑(TNFi和抗CD20)。儘管這些研究大多樣本量小，整體趨勢是一致的。以樣本量最大(n=170)的一項研究爲例，鈣衛蛋白基線水平與臨牀參數基線值(SJC6八、DAS2八、ESR及CRP)有相關性；短時間(16周)治療有效者的鈣衛蛋白降幅最顯著；治療有效者鈣衛蛋白基線水平顯著高於治療失敗者；鈣衛蛋白基線水平高，則短時間治療有效的比值比越高；多變量回歸分析顯示基線高水平鈣衛蛋白是藥物療效的獨立影響因子；利用接收者操做特徵分析(ROC)分別肯定了TNFi和抗CD20臨牀療效(EULAR優良+中等)的鈣衛蛋白基線預測界值。

3、鈣衛蛋白以及S100A9對生物製劑治療RA的療效預測做用

阿姆斯特丹大學醫學院Paul P Tak教授所率團隊在上述最大樣本量研究(n=170)中初步證明MRP8/14對TNFi和抗CD20治療RA的療效預測做用，他們在2016年3月發表了一篇鈣衛蛋白結合臨牀參數輔助實現個體化用藥的概念原型研究(3)。該研究基於基線鈣衛蛋白血清表達水平、臨牀及實驗室指標構建了預測模型，爲臨牀醫生選擇生物製劑（TNFi或抗CD20）提供參考。該研究所歸入研究對象還是前述的170例RA患者。構建預測模型時歸入的基線參數有DAS2八、鈣衛蛋白、IgM-RF、HAQ、既往使用過TNFi等，最後獲得療效預測公式（圖2）。邏輯迴歸分析顯示, DAS28和鈣衛蛋白基線水平越高，則預測達到EULAR優良+中等的可能性越高，而IgM-RF陽性、HAQ基線分值高以及既往用過TNFi則下降得到良好療效的可能性。在得到每例患者的上述基線參數後，該預測模型得出每例患者使用TNFi或抗CD20或良好療效的機率（例如>0.9是高几率，<0.5是低機率，介於這二者之間就是中等機率）。若是TNFi預測療效爲高几率，而抗CD20爲中或低機率，則推薦選擇TNFi，反之則推薦抗CD20；若是TNFi和抗CD20療效機率相同，則不做任何推薦或在兩藥療效機率均低時推薦其它做用機制的藥物。應用預測模型所推薦藥物而獲得的良好療效預期達標率，比實際觀察所得達標率約高10%。

法國學者Antonie Obry等人利用一種基於質譜且無需標記的蛋白組學技術(圖1)在RA患者血清中鑑定出了有可能用於預測依那西普聯合MTX短時間(6個月)臨牀療效的一組蛋白，共7種，其中包括鈣衛蛋白的組成之一S100A9(MRP14)(4)。研究者首先用一組22例RA患者做爲訓練組，其中12例爲治療有效(EULAR反應標準)，10例爲治療無效，從這兩組患者血清中鑑定出12種差別表達蛋白(例如在治療有效組高表達而無效組低表達)。而後，研究者在第二組患者中(7例治療有效，9例治療無效)用上述相同的蛋白組學技術重點驗證上述發現的差別表達蛋白，結果有7種蛋白在第二組治療有效和無效患者之間仍有相同的顯著表達差別，包括CERU、CO七、ITIH一、PLMN、PROS、S100A9和ZA2G，其中前五個屬於急性相蛋白。接收者操做特徵曲線分析顯示, S100A9做爲單獨的療效預測因子的敏感性和特異性分別100%和87.5%。其它6種蛋白的曲線下面積(AUC)均大於0.80，它們中任何一個與S100A9組合的療效預測特異性和敏感性均達到100%。在第一組患者血清中發現最具療效鑑別力的是CO7和PROS，隨後在第二患者血清中用相對定量分析獲得了驗證。用ELISA檢測對這兩種蛋白進行絕對定量後，研究者用ROC分析肯定了它們斷定療效的血清濃度界值，特異性均爲71.4%，二者聯合的療效斷定敏感性和特異性分別爲88.9%和100%。法國學者Antonie

Obry等人在2014年發表的一篇研究採用相同的蛋白組學技術以及兩組小樣本RA患者，已經發現S100A9是MTX初治失敗的RA患者接受依那西普聯合MTX 24周治療的療效預測因子(5)。

4、討論

與RA傳統生物標記CRP和ESR相比，鈣衛蛋白的顯著特色在於它是在關節炎的局部產生並釋放，而CRP主要由肝臟產生，外周血鈣衛蛋白水平上升更準確地反映出炎症關節中白細胞的活化。關於鈣衛蛋白在炎性滑膜的具體起源，目前尚缺少直接證據。因此，就活動性RA的標記物而言，鈣衛蛋白的特異性還未徹底明確，將來還要明確共患病是否也會致使鈣衛蛋白外周血水平上升。

因爲鈣衛蛋白穩定性較好，無需冷藏標本，這將有利於將來多中心研究以及在臨牀實踐的應用。上述系統性綜述建議鈣衛蛋白的檢測方法須要完善和統一。複合生物標記疾病活動度評分(MBDA)目前在RA臨牀實踐中已獲得初步應用，MBDA檢測包含12種蛋白。當初開發MBDA時，鈣衛蛋白也是備選標記，但以後因爲檢測方法學的問題而遭捨棄。將來還要明確異嗜性抗體(例如類風溼因子)是否會干擾鈣衛蛋白的檢測。

荷蘭學者的研究(n=170)顯示生物製劑(TNFi和抗CD20)治療4周時，治療有效者外周血鈣衛蛋白水平就與無效者之間有了顯著差別，而且這一差別持續至16周，這提示外周血鈣衛蛋白可能有助於監測生物製劑的早期療效。

法國學者提到他們利用無標記蛋白組學技術發現的差別表達蛋白與既往高通量蛋白組研究沒有明顯的重疊，例如既往有研究發現單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)可能對依那西普治療RA有療效預測做用，法國學者解釋稱S100A9和MCP-1的共同生物學效能是促進炎性細胞的遷移，並建議將來將兩者放在一塊兒進行驗證(5)。

綜上所述，目前研究代表RA患者鈣衛蛋白外周血水平有顯著的個體差別，外周血水平與疾病活動性有關聯，並隨有效治療而降低。在預測RA的放射學損傷以及藥物療效方面，鈣衛蛋白可能有一些做用，尤爲是聯合其它生物標記(例如臨牀參數、常規實驗室指標以及其它新型蛋白標記)的組合預測做用。可是，鑑於文獻報道的方法學(試驗設計以及實驗室檢測方法)的缺陷，目前的證據水平還不足以將鈣衛蛋白推薦爲常規檢測。爲了嚴格檢驗鈣衛蛋白可否用做類風溼關節炎的生物標記，將來還須要良好設計的大樣本研究，開發合適的統計學模型以控制或校訂混淆因素，對實驗室檢測方法進行標準化等。

表1. 探究鈣衛蛋白做爲RA預後和療效的預測因子的研究

NR:未報告; ROC分析:接收者操做特徵曲線分析; RAAD:類風溼關節炎關節損傷評分;IFX:英利昔單抗; ADA:阿達木單抗; RTX:利妥昔; GC:糖皮質激素; SJC:腫脹關節計數; SAA:澱粉樣蛋白A.

                                      

圖1. 鑑定生物標記的流程示意圖(4)。該流程圖表明無標記定量蛋白組學技術的不一樣實驗階段。在得到樣品以後，先用生化方法抽提蛋白，而後用SDS-PAGE進行電泳以初步分離蛋白。切割收穫不一樣分子量的蛋白膠條，用胰酶對其進行消化降解，然用進行液相層析和質譜分析(LCMS)。相應的質譜檢測結果轉換爲兩維LCMS圖譜(座標軸分別爲m/z(質合比)和滯留時間。能夠對不一樣樣本之間的獨特肽段離子譜進行整合，根據已有蛋白質譜數據對樣本中的肽段進行註釋。最後，根據不一樣蛋白的表明性肽段在樣本中的丰度，肯定特定蛋白的相對錶達水平。

圖2. TNFi和RTX治療RA的療效預測公式

用RTX時Drugtype=0,用IFX時Drugtype=1; RF:類風溼因子; HAQBL:基線HAQ; BLM:基線鈣衛蛋白; DASBL:基線DAS28

參考文獻：

1.張力奮,夏成雲. s100a8/a9在自身免疫性疾病中做用的研究進展.中華臨牀醫師雜誌（電子版）2015:3087–3090.

2. Abildtrup M, KingsleyGH, Scott DL. Calprotectin as a biomarker for rheumatoid arthritis: asystematic review.J Rheumatol2015;42:760–770.

3. Nair SC, Welsing PMJ,Choi IYK, Roth J, Holzinger D, Bijlsma JWJ, et al. A Personalized Approach toBiological Therapy Using Prediction of Clinical Response Based on MRP8/14 SerumComplex Levels in Rheumatoid Arthritis Patients.PloS One2016;11:e0152362.

4. Obry A, Hardouin J,Lequerré T, Jarnier F, Boyer O, Fardellone P, et al. Identification of 7Proteins in Sera of RA Patients with Potential to Predict ETA/MTX TreatmentResponse.Theranostics2015;5:1214–1224.

5. Obry A, Lequerré T,Hardouin J, Boyer O, Fardellone P, Philippe P, et al. Identification of S100A9as biomarker of responsiveness to the methotrexate/etanercept combination inrheumatoid arthritis using a proteomic approach.PloS One2014;9:e115800.