featureCounts 軟件說明

featuresCounts 軟件用於定量，不只能夠支持gene的定量，也支持exon, gene bodies, genomic bins, chromsomal locations的定量；

官網 ： http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/

只須要輸入reads的比對狀況，就是BAM 文件，再輸入一個你感興趣的區間的註釋（一般是基因或者轉錄本的註釋gtf 文件，就能夠了），因此不管是DNA seq 仍是RNA seq, 這個軟件都是能夠定量的。

featureCounts 集成在subreads 軟件中，相似 word 和 office 的關係，subreads 這個軟件也有對應的 R包（Rsubreads）.

featureCounts 須要兩個輸入文件：

1）reads的比對狀況，這種信息一般都用BAM/ SAM文件來存儲

2）區間註釋文件，支持兩種格式

最多見的gtf 格式

simplified annotation format(SAF) 格式， 示例以下

GeneID	Chr	Start	End	Strand
497097	chr1	3204563	3207049	-
497097	chr1	3411783	3411982	-
497097	chr1	3660633	3661579	-

在featureCounts 軟件中，有兩個核心概念：

1） feature , 相似 exon 這種

2) metafeature， 能夠看作是一組 feature, 好比屬於同一個gene 的外顯子的組合

在定量的時候，支持對單個feature 定量（對外顯子定量），也支持對meta-feature 進行定量（對基因進行定量）， meta-feature 的定量是屬於同一meta-features 下的全部features 的總和；

當reads 比對到2個或者以上的features 時，默認狀況下，featureCounts在統計時會忽略到這部分reads, 若是你想要統計上這部分reads, 能夠添加-O 參數，此時一條reads 比對到多個feature， 每一個feature 定量時，都會加1，對於meta-features 來講，若是比對到多個features 屬於同一個 meta-features(好比一條reads比對到了exon, 但這些exon 屬於同一個gene), 則對於這個gene 而言，只會計數1次；

總之，無論對於feature 仍是meta-feature, 只有比對多個不一樣的區間時，纔會分別計數；

定量：

features 支持對單個樣本定量，還支持對多個樣本進行歸一化

單個樣本定量的用法示例

featureCounts -T 5 -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping.sam

多個樣本歸一化的用法示例

featureCounts -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt library1.bam library2.bam library3.bam

下面對幾個經常使用的選項詳細解釋一下：

-a  :  指定的區間註釋文件，默認是gtf格式

-T  :  線程數，默認是1

-t   :  想要統計的feature 的名稱， 取值範圍是gtf 文件中的第3列的值，默認是exon

-g  :  想要統計的meta-feature 的名稱，取值範圍參考gtf 第9列註釋信息，gtf 的第9列爲 key=value 的格式， -g 參數可能的取值就是全部的key, 默認值是gene_id

其餘的一些參數能夠根據本身的目的，實際作調整。

輸出結果的解讀：

featuresCount 會輸出兩個文件，若是-o 指定的是gene, 則會產生gene 和 gene.summary 兩個文件

gene 文件的部份內容以下

# Program:featureCounts v1.6.0; Command:"./featureCounts" "-T" "20" "-t" "exon" "-g" "gene_id" "-a" "hg19.gtf" "-o" "gene" "accepted_hits.bam" 						
Geneid	Chr	Start	End	Strand	Length	accepted_hits.bam
LOC102725121	chr1;chr1;chr1;chr15;chr15;chr15	11869;12613;13221;102516808;102518449;102518943	12227;12721;14362;102517949;102518557;102519301	+;+;+;-;-;-	3220	0
DDX11L1	chr1;chr1;chr1	11874;12613;13221	12227;12721;14409	+;+;+	1652	0
WASH7P	chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1	14362;14970;15796;16607;16858;17233;17606;17915;18268;24738;29321	14829;15038;15947;16765;17055;17368;17742;18061;18366;24891;29370	-;-;-;-;-;-;-;-;-;-;-	1769	88

# 號開頭的註釋行，記錄了產生這個結果文件所用的命令，（感受這個思路特別好，在輸出的文件中記錄當時的命令，便於覈對）

Geneid 開頭的行是表頭，Geneid 表明統計的meta-features 的名稱，Chr ， Start, End 染色體上的位置，Strand 正負鏈，Length 該區間的長度，最後一列的表頭是你的輸入文件的名稱，表明的是這個meta-feature 的count 值，即表達量

接下來看下正文部分，以第一行爲例，在gtf 文件中共gene_id 爲 LOC102725121 的行以下

chr1	refGene	transcript	11869	14362	.	+	.	gene_id "LOC102725121"; transcript_id "NR_148357";  gene_name "LOC102725121";
chr1	refGene	exon	11869	12227	.	+	.	gene_id "LOC102725121"; transcript_id "NR_148357"; exon_number "1"; exon_id "NR_148357.1"; gene_name "LOC102725121";
chr1	refGene	exon	12613	12721	.	+	.	gene_id "LOC102725121"; transcript_id "NR_148357"; exon_number "2"; exon_id "NR_148357.2"; gene_name "LOC102725121";
chr1	refGene	exon	13221	14362	.	+	.	gene_id "LOC102725121"; transcript_id "NR_148357"; exon_number "3"; exon_id "NR_148357.3"; gene_name "LOC102725121";
chr15	refGene	transcript	102516808	102519301	.	-	.	gene_id "LOC102725121"; transcript_id "NR_148357_2";  gene_name "LOC102725121";
chr15	refGene	exon	102516808	102517949	.	-	.	gene_id "LOC102725121"; transcript_id "NR_148357_2"; exon_number "1"; exon_id "NR_148357_2.1"; gene_name "LOC102725121";
chr15	refGene	exon	102518449	102518557	.	-	.	gene_id "LOC102725121"; transcript_id "NR_148357_2"; exon_number "2"; exon_id "NR_148357_2.2"; gene_name "LOC102725121";
chr15	refGene	exon	102518943	102519301	.	-	.	gene_id "LOC102725121"; transcript_id "NR_148357_2"; exon_number "3"; exon_id "NR_148357_2.3"; gene_name "LOC102725121";

對於 LOC102725121 這個meta-features 而言，在gtf 文件中有6個exon的記錄，就是說有6個features , 因此能夠看到對應的Chr, Start, End, Strand 這些列都有；分號分隔的6個值，Length 則是這6個exon 區間的的長度的總和，最後一列就是LOC102725121的表達量

這個結果文件有1個問題，就是同一個gene_id 會有多個染色體編號，這是由於gtf 文件中的gene_id 不是惟一標識符致使的，這樣和咱們想要的定量結果是不同的，因此在實際分析中，應該挑選gtf 文件中的惟一標識符；

總結： 

這個軟件最大的特色就是運以行的很是快，幾分鐘就能夠運行完1我的類基因組樣本的定量；可是準備gtf 文件時，要確保-g 參數指定的值都是惟一標識符，才能達到預期的效果；