單細胞測序方法大比拼

〖生物技術〗單細胞測序方法大比拼

• 測序技術

導讀 在單細胞研究的大潮中，新的測序方法層出不窮。不過，不多有人對這些方法進行系統的比對。慕尼黑大學生物學家Wolfgang Enard最近領導團隊，在小鼠胚胎幹細胞的基因表達研究中比較了一

導讀

在單細胞研究的大潮中，新的測序方法層出不窮。不過，不多有人對這些方法進行系統的比對。慕尼黑大學生物學家Wolfgang Enard最近領導團隊，在小鼠胚胎幹細胞的基因表達研究中比較了一些經常使用的單細胞測序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。

Smart-seq

SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一個具備里程碑意義的重要技術。實際上，可以從單細胞生成全長cDNA的測序方案並很少，Smart-seq就是其中之一。對於等位基因特異性表達或者剪接變體研究來講，覆蓋整個轉錄組是一件很是重要的事情。

Fluidigm C1單細胞製備系統可以自動完成Smart-seq步驟。你只須要將製備好的細胞懸液加進去，儀器就會分離並裂解細胞，把mRNA逆轉錄爲cDNA，再對cDNA進行擴增。擴增後的cDNA能夠拿來測序，也能夠進行qPCR檢測。

在Enard的比較研究中，Fluidigm C1系統的Smart-seq最爲靈敏，成本也最高。這一系統使用的微流體芯片不能重複使用，不過這種芯片能夠放到顯微鏡下觀察，證明健康單細胞的存在。

CEL-seq

CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一種採用線性擴增的經常使用測序方法。線性擴增的主要優點是錯誤率比較低，不過線性擴增和PCR都存在序列依賴性偏好。

CEL-seq技術發表於2012年，主要是分離單細胞，逆轉錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片斷，給它們貼上表明其細胞來源的條碼。2014年Science雜誌發佈的MARS-seq與CEL-seq很相似。

CEL-seq和其餘線性擴增方法生成文庫花費的時間要稍微長一點。不過，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼並進行混合，大大減小了手動操做的時間。PCR是在最後階段使用的，主要是爲了鏈接正確的測序接頭，CEL-seq開發者紐約大學的Itai Yanai介紹到。

CEL-seq所需試劑都是現成的，大約兩天時間生成測序文庫和測序數據，Yanai指出。須要注意的是，CEL-seq與大多數方案同樣，測序轉錄本的3’端。Enard等人並無親自嘗試着一技術，只是在比較研究中用到了CEL-seq數據。從這項研究來看，CEL-seq的重現性最好。

GitHub網站提供有CEL-seq可用的生物信息學工具。Yanai研究團隊正在開發新版本CEL-seq2，新版本的靈敏度將比舊版本高三倍。

SCRB-seq

Broad研究所開發的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技術採用的是PCR擴增。該技術須要結合流式細胞儀（FACS）或者其餘細胞分選方法，把單細胞分配到微孔裏去。

SCRB-seq與Smart-seq比較類似，只不過SCRB-seq會整合特異性的細胞條碼，以分辨擴增分子的來源，更準確的定量轉錄本。此外，SCRB-seq並不生成全長cDNA，而是像CEL-seq同樣富集RNA 3’端。

2014年，開發者們將SCRB-seq技術提早發佈在BioRXiv上。隨後他們對這一技術進行了更新，並將其改名爲「high-throughput eukaryote 3’ digital gene expression」。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技術服務，SCRB-seq也被整合到了Wafer GenBio systems公司的scRNA-seq平臺上。聽說Fluidigm公司的C1系統很快也將支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard最中意的測序方法，它不只適用於單細胞RNA測序，還能支持大量細胞（bulk）的RNA測序。惋惜的是SCRB-seq並很差DIY，研究者本身很難將測序流程與FACS對接起來。

DROP-seq和inDROP

哈佛醫學院的研究人員開發了以微滴爲基礎的兩種獨立技術Drop-seq和inDrop。他們利用微流體裝置將帶有條碼的微珠和細胞一塊兒裝入微小的液滴，創建了快速、廉價、高通量的單細胞RNA-seq方法。這兩種技術將細胞隔離在微小的液滴中，裝上用於擴增的條碼引物，由此檢測數以千計的細胞。研究者們認爲，Drop-seq和inDrop可以幫助生物學家進一步發現和分類人體細胞，繪製大腦等複雜組織的細胞多樣性圖譜，更好地瞭解幹細胞分化，得到更多疾病的遺傳學信息。

Enard及其同事發現，Drop-seq在單個細胞中檢測的基因數還不到Smart-seq/C一、CEL-seq和SCRB-seq的一半。不過，在統計學水平上研究差別性表達的時候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是最划算的。哈佛醫學院Steve McCarroll實驗室去年下半年根據用戶反饋，在本身網站上公佈了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。

參與開發SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建本身的Drop-seq平臺。Semrau從Whitehead生物醫學研究所搬到Leiden物理研究所的時候，發現本身用FACS已經不那麼方便了，因而他爲新實驗室選擇了Drop-seq。創建微流體芯片和液滴系統是整個過程當中最艱難的部分，不過Semrau實驗室的一名微流體博士後僅用三週就搞定了這些問題。Drop-seq文庫製備是任何分子生物學研究者都熟悉的標準操做。據Semrau估計，搭建和優化Drop-seq大概只須要六個月時間。

 

四種單細胞RNA-seq方法比較