（基因功能 & 基因表達調控）研究方案

作了很久的RNA-seq分析，基因表達也在口頭溜了幾年了，但彷佛總是浮在表面。

對一件事的瞭解程度決定了你的思惟深度，只想作技工就不用想太多，想作大師就必定要刨根問底。

總是說基因表達，那麼什麼是基因表達？咱們測序獲得的基因表達其實只是一種表型，是樣本的一個快照，和普通的身高體重之類的連續型表型相似。

常規的轉錄組分析本質上都是表型分析，clustering、pseudotime、DEG、marker，在這些分析中，每一個基因都是獨立的維度，屬於靜態的分析，此時咱們關注的是某個基因的功能分析，好比RET，功能已經明確，那就能夠用基因表達這個表型來解釋另外一個表型。

高通量測序還會有後續的分析，幾萬個基因不可能一個一個的研究，GO和KEGG分析就來了，基因不是互相獨立的，GO term和pathway的概念就來了。GO和KEGG的本質是規範了基因之間的關係。GO整合了全部物種，是從生命系統的角度來統一基因的關係，這種關係只是一個集合；KEGG是針對一個物種來界定基因之間的關係，這種關係是有向圖結構。必須再深刻了解GO和KEGG的製做原理，暫時不深刻。此時咱們開始區分基因類型，蛋白編碼、非編碼、轉錄因子。在這個階段咱們更關注的是基因之間的調控關係。

中心法則揭示了生命系統的層級和管道結構，和計算機的通訊系統很相似，就算上游的基礎調控再複雜，下游的蛋白都是決定性因素，因此使人驚歎的是上游調控如此複雜多變，可下游的蛋白確是很是穩定，這說明覆雜多變的調控是很是穩定的。

 

基因研究的第一步必然是基因的功能，其次纔是基因的調控。

 

基因功能 

那麼如何研究一個基因的功能呢？參考：＃基因組觀＃基因功能研究的「七大絕招」與「三板斧」 - BioinforCN

簡單總結一下這篇文章：

1. 天地人和，研究基因表達的時空規律來推測功能，這和偵探調查是同樣的，屬於間接推理；

2. 患得患失，就是直接操做基因，knock out或down或overexpress，來直接探索基因的功能，屬於直接觀察；

3. 上下求索，由於中心法則是個層級和管道系統，上下游十分明確，從基因的DNA、RNA到蛋白質，一塊兒研究；

4. 十面埋伏，立體論證，作生物的很容易觀察到假陽性，必須多角度論證；

5. 其餘的，misexpression、in vitro/vivo。

 

不說人類hs了，假設你負責一個全新的物種的基因組和基因功能研究，你如何找到該物種的全部基因呢？

看任何一篇基因組組裝文章都能找到解決方案。那咱們就看看嚴建兵的最新的玉米的NG吧，Genome assembly of a tropical maize inbred line provides insights into structural variation and crop improvement。

微信文章：《Nature Genetics》| 玉米產量相關基因找到了 | 熱帶玉米基因組及高精度結構變異圖譜成功構建，助力玉米遺傳改良

首先是基因組DNA的組裝，Genome sequencing, assembly and scaffolding，這部分純技術，之後估計都不要組裝了，直接把基因組測出來；

其次就是基因組註釋了，Genome annotation，這部分是咱們如今最感興趣的部分，如何找到一個新物種內的全部基因？

A comprehensive strategy combining de novo gene prediction, protein-based homology searches, RNA sequencing (RNA-Seq) and isoform sequencing (Iso-Seq) of nine tissues (Supplementary Table 6) was used to annotate the genes (Supplementary Fig. 7).

方案來了：

1. 基因是有特殊結構的，因此只要有DNA序列，就能夠作denovo預測；

2. 中心法則告訴咱們DNA、RNA和蛋白質是環環相扣的，全部測RNA-seq和iso-seq能夠間接推出基因；

3. 蛋白測序尚未普及，因此目前都用的同源蛋白序列來反推；

這樣註釋出來的只是很general的基因註釋，能cover絕大多數基因，但某些特殊結構的確定沒法註釋出來。

有了草圖，後面再作實驗的功能研究就會方便不少。

基於高通量測序的前兩步只能告訴你基因組的這個地方是個基因，可是不可能告訴你它的功能；第三步就是基於已有的知識了，作同源推理。因此目前來看全部的生物知識都是來源於實驗的，測序只是一個加速的輔助手段而已。

能夠沒有測序，可是不能沒有實驗，測序是科研加速的催化劑。

文章結果：

 

GENE FINDING METHODS - broad institute - 很全面

 

基因表達調控/轉錄調控

教科書解釋：

1. 染色體和染色質水平的結構變化，致使基因活性變化；Hi-C，bulk平均好些，sc的量太少不靠譜
2. 轉錄水平調控；轉錄因子，enhancer，promoter，ncRNA
3. RNA加工水平調控，剪切修飾編輯降解；甲基化，lncRNA抑制降解
4. 轉錄後，細胞核向細胞質轉運；HDAC4
5. 翻譯水平；
6. 蛋白合成水平；蛋白修飾定量，不是AA測序

目前最火的兩個能夠用高通量測序研究的調控方法：

• 轉錄因子，enhancer，promoter
• 非編碼RNA，lncRNA、miRNA、ceRNA

參考：

Modes of transcriptional regulation

Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease

 

項目問題：

如今in vivo和in vitro模型都已成熟，RNA-seq成本你們均可以接受了，CRISPR技術也成熟了，KO一個基因已經變得很是容易，如今發育生物學、生物醫學等都在這麼作：KO一個基因，來探索本身感興趣的生物過程發生了哪些變化。 

如今問題來了，KO後表型確定發生了變化，那麼如何把這個表型和基因表達和調控聯繫到一塊兒呢？

這是一個general的問題，解答好了能夠用於任意一個基因的深刻研究。

大致解決方案：

假設檢驗是科研獲取真知的惟一手段，首先咱們必需要一個合理的假設，而後去尋找各類證據來test這個假設。

沒有假設和驗證就不是作科研，那就是一個技工得出一份沒有意義的結題報告。 

 

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問題：

1. RNA-seq的建庫方案有哪些？ployA、隨機等。只抓有polyA的MRNA會有哪些優點和缺點？ployA只有mRNA有，因此polyA建庫只能抓到蛋白編碼基因，不多部分地ncRNA。參見連接

2. 細胞核和所有測序的區別？

3. 基因的長度差異到底有多大？

4. 可變剪切和isoform是如何影響蛋白的？

5. KEGG裏面已經有基因的關係了，爲何咱們還要研究基因調控？

6. 蛋白互做網絡的用途和侷限性是什麼？

7. 蛋白是惟一的決定性因素嗎？是的，絕大多數DNA和RNA層面的變化都會最終改變蛋白的功能。好比HSCR的沒法造成ENS就是一個複雜的表型，能夠確定的是某些蛋白的功能執行紊亂了。

8. 基因表達的高低重要，仍是基因表達的on/off重要？

9. 基因是如何找到和定位的？基因的編碼的蛋白是如何肯定的？

10. 如何理解基因之間的關係，是什麼性質的關係？

11. 如何當即基因的拷貝數對基因表達的影響？

12. transposable-element對基因表達的影響？

13. 基因的經典結構是什麼樣的？什麼是CDS和UTR？能夠結合目前主流的基因預測工具來看。

14. 轉錄調控和蛋白互做有什麼聯繫和區別？

 

Typical structure of a mature eukaryotic mRNA (AUG, UAA/UAG/UGA)

 

 

待續~