一文讀懂基因測序技術的前世此生

一文讀懂基因測序技術的前世此生

 隨着人們對自身基因遺傳信息的瞭解和掌握，使得基因檢測技術不斷髮展和完善，基因檢測技 術也獲得了迅猛發展，下面就和小編一塊兒看看這些年測序技術的發展歷程。 測序技術的每一次變革，都是對基因組研究，疾病醫療研究，藥物研發等領域的巨大推進做用。

從1977年第一代DNA測序技術（Sanger法），發展至今三十多年時間，測序技術已取得 了至關大的發展，從第一代到第三代，測序讀長從長到短，再從短到長。雖然就當前形勢看來 第二代短讀長測序技術在全球測序市場上仍然佔有着絕對的優點位置，但第三測序技術也已在 這一兩年的時間中快速發展着。 根據原理的不一樣，人們將測序技術發展分爲三個階段，第一代，sanger測序。第二代，高通量 測序（NGS）。第三代，單分子/納米孔測序。因爲三代測序技術各有優缺點，應用的領域也 不盡相同，第一代測序技術仍未被淘汰，目前的測序市場是三代測序技術並存的局面。

第一代：sanger測序

第一代測序技術，主要基於 Sanger雙脫氧終止法的測序原理，結合熒光標記和毛細管陣列電 泳技術來實現測序的自動化，基本方法是鏈終止或降解法，人類基因組計劃就是基於一代測序 技術。第一代的Sanger測序技術的優勢是，測序讀長長，能達到800-1K bp，且測序用時短，只須要幾十分鐘便可完成一次測序，測序準確度高準確性高達99.999%，目前還是測序的 金標準；

缺點是通量低、成本高，影響了其真正大規模的應用。

於是第一代測序技術並非最理想的測序方法。通過不斷的技術開發和改進，以Roche公司的 454技術、illumina公司的Solexa，Hiseq技術和ABI公司的Solid技術爲標記的第二代測序技 術誕生了。

第二代測序技術大大下降了測序成本的同時，還大幅提升了測序速度，而且保持了高準確性，之前完成一我的類基因組的測序須要3年時間，而使用二代測序技術則僅僅須要1 周，但在序列讀長方面比起第一代測序技術則要短不少。

第二代：高通量測序（NGS）

高通量測序技術（又稱爲下一代測序，Next Generation Sequencing，NGS）自2005年454 公司推出第一臺基於焦磷酸測序二代測序儀開始，到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列， 高通量測序技術經歷了十幾年的技術發展過程，NGS測序平臺也經歷了一系列的收購和合並， 最終造成主要三家測序平臺，包括：Illumina的Solexa平臺、Life Technologies的 Ion Torrent平臺和華大基因的Complete Genomics平臺。

1.Illumina平臺

因爲其技術成熟，平臺之間高度互補性與交叉性，使得其在短讀長測序上大佔優點，是目前應 用最普遍的NGS平臺。目前其佔據了測序儀市場約70%的市場份額。

2.Life Technologie平臺

Life公司Ion Torrent測序平臺採用的爲半導體測序原理，其在非鹼基多聚體（nonhomopolymer）的測序上正確率與其它NGS平臺相差無幾，而對於連續鹼基的檢測還不夠完 善，在檢測同一鹼基連續出現時的數量可能會有所偏差。相對於其餘平臺，測序通量較小，平 臺數量也較少。

3.Complete Genomics平臺

Complete Genomics平臺採用了高密度DNA納米芯片技術，在芯片上嵌入DNA納米球，而後 用複合探針-錨定分子鏈接（cPAL）技術來讀取鹼基序列。雖然這些技術很是準確，但該技術 在應用上最大的限制可能就是其太短的讀長。

高通量測序技術經歷了十幾年的飛速發展，人類基因組測序成本已經從人類基因組計劃的約30 億美圓降到了1000美圓左右。目前二代測序設備在通量、準確度上都有了較大的提升，同時 測序成本也隨之大幅度降低，成爲商用測序的主流。

第三代：單分子/納米孔測序

測序技術在近兩年中又有新的里程碑，Helicos公司的Heliscope單分子測序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技 術，被認爲是第三代測序技術。與前兩代技術相比，他們最大的特色是單分子測序，測序過程 無需進行PCR擴增，其中，Heliscope技術和SMRT技術利用熒光信號進行測序，而納米孔單 分子測序技術利用不一樣鹼基產生的電信號進行測序。

因爲第二代技術存在短讀長和耗時長的缺陷，人們但願第三代測序技術能解決這些缺陷，第三 代測序技術經過現代光學、高分子、納米技術等手段來區分鹼基信號差別的原理，以達到直接 讀取序列信息的目的，三代測序設備在DNA 序列片斷讀長上優於二代設備，但在準確度上較 二代設備差，目前還沒有徹底成熟，市場應用面還不算廣，將來隨着技術的改善，三代測序設備 將更爲穩定和成熟。

 

第三代測序優點：

1）第三代基因測序讀長較長，如Pacific Biosciences 公司的 PACBIO RS II 的平均讀長達到 10kb，能夠減小生物信息學中的拼接成本，也節省了內存和計算時間。

2）直接對原始DNA樣本進行測序，從做用原理上避免了 PCR 擴增帶來的出錯。

3）拓展了測序技術的應用領域，二代測序技術大部分應用基於DNA，三代測序還有兩個應用 是二代測序所不具有的：第一個是直接測RNA的序列，RNA的直接測序，將大大下降體外逆 轉錄產生的系統偏差。第二個是直接測甲基化的DNA序列。實際上DNA聚合酶複製A、T、 C、G的速度是不同的。正常的C或者甲基化的C爲模板，DNA聚合酶停頓的時間不一樣，根據 這個不一樣的時間，能夠判斷模板的C是否甲基化。

4）三代測序在ctDNA，單細胞測序中具備很大的優點：ctDNA含量很是低，三代測序技術靈 敏度高，可以對於1ng如下作到監測；在單細胞級別：二代測序要把DNA提取出來打碎測序， 三代測序直接對原始DNA測序，細胞裂解原位測序，是三代測序的殺手應用。

第三代測序缺陷：

1）整體上單讀長的錯誤率依然偏高，成爲限制其商業應用開展的重要緣由；第三代基因測序 技術目前的錯誤率在15%-40%，極大地高於二代測序技術NGS的錯誤率（低於1%）。不過好 在三代的錯誤是徹底隨機發生的，能夠靠覆蓋度來糾錯（但這要增長測序成本）。

2）三代測序技術依賴DNA聚合酶的活性。

3）成本較高，二代Illumina的測序成本是每100萬個鹼基0.05-0.15美圓，三代測序成本是每 100萬個鹼基0.33-1.00美圓。

4）生信分析軟件也不夠豐富。

三代測序和二代測序相比較，第二代測序技術的優勢是成本較之一代大大降低，通量大大提 升，但缺點是所引入PCR過程會在必定程度上增長測序的錯誤率，而且具備系統偏向性，同時 讀長也比較短。第三代測序技術是爲了解決第二代所存在的缺點而開發的，它的根本特色是單 分子測序，不須要任何PCR的過程，這是爲了能有效避免因PCR偏向性而致使的系統錯誤，三 代讀長超長，準確低，費用高，但因讀長長，利於組裝和發現unique reads潛在優點明顯，但 是劣勢也限制了三代測序的商業應用。

 

將來前景

目前，第二代的基因測序技術高通量測序（NGS）是市場商用主流。

第三代的單分子/納米孔 測序將是將來的大勢所趨，可是預計在未來5-10年內2、三代基因測序會共存，但二代測序仍 將是測序市場商業應用主流