生信-使用NCBI進行目的基因的引物設計

使用NCBI進行目的基因的引物設計

全文概述

利用生信工具進行目的基因的引物設計，使用了NCBI進行篩選與設計引物，使用 idtdna對篩選出的DNA進行檢查。本文分享瞭如何篩選出高質量的基因引物，幫助想經過生信進行引物設計的學生、從業者找出合適的基因，畢竟購買引物也比較燒錢，避免設計出的基因質量偏低。

NCBI查找基因

1.查詢目的基因：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=zbed3

備註：這裏須要注意的是，要找到合適的目的基因！若是找智人，通常會是NM開頭

2.選擇其中一個數據鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001329564.2，選擇Pick Primers

3.進入：

設計-篩選設置

4.根據一些實驗經驗調節一些關鍵參數：

1）Primer Parameters-PCR product size：設置爲75-300

2）Exon/intron selection- Exon junction span：設置必須跨越外顯子（Primer must span an exon-exon junction），避免污染

3） Advanced parameters - Primer Parameters：GC建議在40%-60%之間

5.點擊Get Primers

6.跳轉頁面

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1561727583&job_key=v7VgKRZ5G9E86w3uAI4p3HqVOO5XhiPzVg

7.挑選合適的primer pair，其中product length最好是在150附近（不是絕對）

設計-DNA檢查

8.註冊idtdna進行dna分析，https://sg.idtdna.com/calc/analyzer

9.抽取其中一個primer pair

Primer pair 6

Sequence (5'->3')	Template strand	Length	Start	Stop	Tm	GC%	Self complementarity	Self 3' complementarity
Forward primer	ACAGCAACACAGAAGACCGT	Plus	20	604	623	59.82	50.00	3.00	3.00
Reverse primer	CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC	Minus	21	749	729	59.87	52.38	6.00	3.00
Product length	146
Exon junction	737/738 (reverse primer) on template NM_001115114.1

Products on intended target

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NM_001115114.1 Danio rerio glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh), mRNA

product length = 146

Forward primer 1 ACAGCAACACAGAAGACCGT 20

Template 604 .................... 623

Reverse primer 1 CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC 21

Template 749 ..................... 729

10.使用idtdna進行篩選

舉例：正旋：ACAGCAACACAGAAGACCGT，反旋：CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC

以此使用正旋與反旋填寫入sequence，如圖使用正旋，點擊self-dimer，若是序列結果中，basePairs都小於10，那麼這個引物就算比較好的了，不是自旋產生的。

11.接着正反計算，輸入正反旋，年級HETERO-DIMER,最後點擊CALCULATE，若是序列結果中，basePairs都小於10，那麼這個引物就算比較好的了，不是自旋產生的。