新冠肺炎到底是從何時就開始傳播的？這個問題跟病毒溯源同樣很是具備挑戰性。html
日前來自西班牙巴塞羅那大學腸道病毒小組的一項研究讓人大吃一驚。研究小組表示，在去年 3 月採集的巴塞羅那廢水樣本中檢測出了新冠病毒，這項研究結果 6 月 13 日發佈在預印本論文平臺 medRxiv 上；6 月 26 日，西班牙巴塞羅那大學官網再次對這項研究進行了報道，從而引起業內巨大爭議。web
根據公開報道，歐洲在 2020 年 1 月下旬纔在法國報告了首個新冠病例，而西班牙本土直到 2020 年 2 月 25 日才報告確診首例新冠患者。若是這項研究證據確鑿，那意味着新冠疫情演變的時間順序可能要發生重大變化，世界各地在新冠暴發以前就已經存在感染了。測試
領導該研究小組的巴塞羅那大學生物學教授阿爾伯特·博世（Albert Bosch）表示，研究小組檢查了 2018 和 2019 年的廢水樣本，目前僅在 2019 年 3 月 12 日的樣本中，新冠病毒 PCR 檢測呈現陽性，但病毒水平很是低，其餘全部樣本的檢測結果均爲陰性。spa
他認爲，巴塞羅那旅遊業發達，遊客衆多，這一研究結果代表世界其餘地區極可能也發生了相似狀況，許多病例在早期可能被誤診爲流感病例，從而被掩蓋了。htm
圖｜巴塞羅那大學官網新聞（來源：巴塞羅那大學）
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新冠病毒去年3月已現身？ci
這項研究是由巴塞羅那大學的羅莎·平託（Rosa Pintó）和阿爾伯特·博世教授領導該校腸道病毒研究小組人員完成的，是新冠病毒「哨兵監測計劃」的一部分，資助方爲蘇伊士環境集團，它是全球最大的水務公司之一。雙方合做試圖在廢水中檢測病毒，並考慮爲未來新冠疫情的潛在暴發採起預案措施。it
儘管新冠肺炎是一種呼吸系統疾病，但諸多研究已證實在患者糞便排泄物中存有大量的冠狀病毒基因組，病毒最終混合到廢水中，這是基於廢水研究新冠流行病學的理論依據，有望在人們還沒有察覺的疫情早期檢測病毒在人羣中的傳播，特別是能囊括無症狀人羣的存在。社區
此前，已有多國研究人員試圖經過廢水檢測的方式來判斷疫情暴發後的潛在波及面有多普遍，覺得下次疫情暴發檢測提供參考。對此，DeepTech 曾在一文中進行了報道。ast
巴塞羅那第一例病例於 2020 年 2 月 25 日被報告出來，截至 2020 年 5 月底，該地區病例總數超過 17500 例，是西班牙的重點疫情區。
爲了探明巴塞羅那新冠疫情的演變過程，從 2020 年 4 月 13 日到 5 月 25 日，研究人員開始每週對來自兩個大型污水處理廠( WWTP1 和 WWTP2 )的 24 小時複合污水樣本進行分析，以檢測 SARS-CoV-2 的存在狀況。此外，也對 WWTP2 的冷凍污水樣品進行了檢測，這部分冷凍樣本時間段是 2018 年( 1 月至 3 月)、2019 年( 1 月、3 月、9 月至 12 月)和 2020 年( 1 月至 3 月)。
具體方法是，經過用 20％ 聚乙二醇 6000 沉澱將 800 毫升廢水樣品濃縮，並重懸於 3 毫升 pH 7.4 的 PBS 中， 從 1 毫升濃縮物中進行核酸提取，並使用提取系統以 50 微升洗脫。研究方案採起實時 RT-PCR 檢測新冠病毒。
圖｜巴塞羅那大學污水研究的部分檢測結果（來源：medRxiv）
重點狀況發生在 WWTP2 樣本中，由於該組樣本覆蓋 2019 年 12 月至 2020 年 5 月的時間段，這就有可能更好地分析污水中基因組拷貝數的動態。分析結果出乎人意料，對該組檔案樣本的分析代表，在 2020 年 1 月 15 日至 3 月 4 日樣本中，新冠病毒的基因組就在不斷增長，更值得注意的是，巴塞羅那宣佈第一例新冠病例( 2 月 25 日)前 41 天( 1 月 15 日)在污水中就能檢測到新冠病毒了，研究者認爲，這證實廢水監測可以有效地預測新冠病例的人口規模。
此外，因考慮到大多數新冠病例會表現出輕微的流感樣症狀，所以流感病例可能在 2019-2020 年暴發季掩蓋了新冠病例狀況。這種可能性促使研究人員分析了 2018 年 1 月至 2019 年 12 月的一些存檔 WWTP2 樣本，結果顯示，在 2019 年 3 月 12 日的樣本中， IP2 和 IP4 靶點檢測均呈陽性。
這一結果的驚人之處在於，它指向早在全球任何新冠病例報告以前，該病毒就在巴塞羅那流通，當地社區中傳播着被忽視的新冠病例。
「巴塞羅那是一個商業和旅遊中心，也是諸多大型活動的熱門場所，巴塞羅那接待了許多外地遊客。」博世認爲，「世界其餘地區也可能發生了相似的狀況，並且因爲大多數新冠病例表現出與流感類似的症狀，這些病例可能假裝成了未確診的流感。」
業內專家紛紛質疑
新型冠狀病毒的出現比人們目前已知的要早得多嗎？不少專家對巴塞羅那大學的這項研究表示質疑。
首先，人們懷疑樣品被污染。國內一位從事分子生物學研究的研究人員告訴 DeepTech，西班牙這項研究樣品製備的濃縮步驟不合適，不規範。
具體而言，其病毒濃縮方法不合適，他們採用了一種聚合物沉澱的方法，須要加入 200 克的某種聚乙二醇，這是一種大量製備病毒的經常使用方法，而不是微量分析病毒的規範方法。由於假如稍微有污染，其中試劑自己雜質量就會超過病毒，加上未作空白對照實驗，就會給出錯誤結果。
更好的辦法是採用膜吸附的方法，能夠確保沒有任何污染。若是加上有空白對照就會萬無一失。這位研究人員認爲，西班牙研究還須要公佈測得的基因序列，以便確認是否污染了年初以來的新冠病毒。
圖｜日內瓦新興病毒病中心教授伊莎貝拉·埃克爾（Isabella Eckerle）表示質疑（來源：Twitter）
香港大學病毒學專家金冬雁教授對 DeepTech 表示，西班牙這項研究檢測的是冠狀病毒的高度保守區，由於還多是其它冠狀病毒，只有公佈所測樣品中冠狀病毒基因序列，纔可對照分析。另外的問題是，樣品擴增了不少倍，卻只有很低水平的病毒結果，加上缺少多樣本檢測，這就很難排除不是樣品污染。
與中國專家的質疑相似，這項新研究結果挑戰了目前有關該病毒起源和時間的共識。迄今爲止，世界上關於新冠病毒的最先最詳細的研究證據都源於 2019 年 12 月的中國武漢地區，而且在 2020 年 2 月疫情纔在西班牙出現。
很多外國學者在論文評論區指出了這項新研究的問題，該研究還沒有受到外部專家的嚴格審查，他們認爲，因爲污染或樣品存儲不當，測試樣本極可能會產生假陽性。
密歇根州立大學環境工程師艾琳·薩戈拉拉基（Irene Xagoraraki）說：「我不相信這個結果。他們的大多數報告內容都描述了從 2020 年初開始的廢水處理研究，而關於 2019 年 3 月的最使人驚訝的發現僅在報告末尾才粗略提到。」
對此，西班牙公共衛生與衛生行政管理協會的瓊·拉蒙·比利亞比（Joan Ramon Villalbi）博士表示，如今得出明確的結論還爲時過早。
他說：「當前只是一個項目的研究結果，但咱們惟有參照更多的數據、更多的研究、更多的樣品，來確認並排除該實驗室的錯誤或方法學漏洞問題。」
被大幅提早的時間
幾十年來，公共衛生工做者一直在污水中尋找各類病毒暴發的跡象，世界衛生組織已經經過這種方式監測了脊髓灰質炎病毒，以評估其疫苗接種運動的效果。這項新研究結果是否是爲了博眼球目前尚不能定論，但關於新冠病毒出現的時間，一直在被提早。
此前，其餘組織和機構的研究人員們已在荷蘭、法國等地的廢水中成功檢測出新冠病毒的痕跡，但一般狀況下，這些研究都是在當地發現疫情以後檢測到的。
荷蘭 KWR 水循環研究所的微生物學家格特詹·梅德馬（Gertjan Medema）認爲，一個污水處理廠能夠收集超過 100 萬人的廢水，與逐我的進行測試相比，分析規模級的廢水能夠更好地估計新冠病毒的傳播範圍，由於廢水檢測能夠囊括那些未經檢測、症狀輕微或無症狀的人，而衛生當局可能只看到了冰山一角，只關注到了那些發病或重症的人。
此前，荷蘭國家公共衛生與環境研究所的研究團隊在首都阿姆斯特丹的主機場的廢水中檢測到了新冠病毒蹤影，這距離荷蘭證明其第一例新冠病例僅過了 4 天。
塞巴斯蒂安·伍茲（Sébastien Wurtzer） 是上市公司 Eau de Paris 的病毒專家，該公司負責巴黎市公共供水和廢水收集，他們的研究指出，病毒 RNA 在 2020 年3 月 10 日以前的幾天內開始呈現出「高濃度」，而這是巴黎記錄到新冠肺炎多人死亡的第一天。
圖｜污水研究人員從下水道中取樣（來源：法新社）
近期，很多研究人員表示在確診病例開始出現以前的幾天就提早發現了廢水中病毒含量水平的升高。
例如路透社在 6 月 19 的報道，意大利科學家在 2019 年 12 月從米蘭和都靈收集的廢水中發現了新的冠狀病毒的痕跡，這代表在中國報告首例病例以前，新冠病毒已在乎大利北部傳播。
意大利國家衛生研究院研究了從意大利北部的廢水處理廠收集的 40 個污水樣品，這些樣品是在 2019 年 10 月至 2020 年 2 月之間收集的。分析結果顯示，12 月 18 日在米蘭和都靈採集的樣品存在新冠病毒。科學家表示，在 2019 年末以前檢測到該病毒的痕跡與其餘國家的證據一致，即在中國於 12 月 31 日發佈首個疫情通報以前，新冠病毒可能已經在傳播。
相比之下，巴塞羅那大學的這項新研究把這個時間點一下提早了半年多，讓人難以置信。最明顯的問題在於，這項研究發現新冠病毒可能在 2020 年 3 月份出現，但在日後的諸多樣本中卻沒有出現，有點兒違背邏輯。
該項研究的主要負責人阿爾伯特·博世說：「呼吸道病毒一般在每一年的這個時候達到高峯。」 「而後病毒可能消失了。」
艾琳·薩戈拉拉基博士認爲，陽性結果有多是其餘樣本感染病毒的結果。她還懷疑，若是樣本沒有被深度冷凍，這種冠狀病毒是否可以存活一年以上？她說：「若是樣本沒有儲存在 -80 度環境下，你就不能相信結果。」
荷蘭 KWR 水研究所的格特詹·梅德馬則表示，這項研究來自「知識淵博的研究團隊」，所以應認真對待。他補充說：「他們須要以多種方式確認這一發現。」
遺憾的是，這項驗證明驗可能已難以重複。阿爾伯特·博世對外迴應，他的團隊沒法在陽性樣本中重複實驗，由於它在第一次測試中就被消耗掉了。他說：「咱們從該樣本中證實了這一點，但咱們沒法重複。但樣本污染是不可能的。在咱們的工做方式中，當有污染時，咱們會注意到它。」
固然，證明這一發現的另外一種方法是，從 2019 年 3 月在巴塞羅那醫院的患者那裏蒐集的血液樣本進行搜索，若是病毒在西班牙傳播，甚至短暫傳播，那麼有些人極可能會因流感樣症狀而住院。
但綜合來看，這項研究進行第二輪實驗求證彷佛是難上加難的。
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參考：https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.06.13.20129627v1https://www.nytimes.com/2020/06/26/health/coronavirus-spain.htmlhttps://www.ub.edu/web/ub/en/menu_eines/noticies/2020/06/042.htmlhttps://www.reuters.com/article/us-health-coronavirus-italy-sewage/italy-sewage-study-suggests-covid-19-was-there-in-december-2019-idUSKBN23Q1J9