三代測序技術概況

第三代長序列測序技術爲得到高質量的基因組數據提供了機遇。二代測序會產生不少數百個鹼基大小的讀長，而三代測序的讀長能夠長達10kbp。這種長讀長對基因組的從頭組裝、基因組結構變異和基因分型（phasing）有重要的意義。

自從二代測序技術商業化以來，不少測序平臺相繼出現，好比Roche/454（2005年），Illumina/Solexa（2007年）等。這些測序平臺使得測序價格大幅降低。所以，人們能夠測定不少新物種序列，同時還可以研究不一樣種羣的基因組多樣性。可是二代測序對研究基因組結構變異卻十分困難。並且，經過二代測序技術對新基因組的從頭測序結果也並不理想，甚至不如以前老的方法準確，容易形成基因組片斷的缺失。即使是對基因組的重測序也很難進行基因組結構變異的研究。

不過經過單分子測序則能很大程度上解決這些二代測序技術的不足。單分子測序的讀長可以達到10kbp，甚至超過100kbp。這麼大的長度對研究基因組結構變異提供了很大的方便。

更爲重要的是，長讀長可以很準確的顯示出重複序列，或者連續性更好的基因組。還可以很容易的識別出插入缺失突變、轉座、倒置等結構變異。同時單分子測序的測序深度在基因組上分佈比較均一，不會像二代測序那樣受序列內容影響（如GC含量）形成不少區域的測序深度下降甚至缺失。【GC含量高的序列容易形成測序深度偏低】。經過這種第三代長測序技術可以造成一個超級contig（scaffold），有時甚至能夠覆蓋整個染色體的一條臂。

三代測序技術已經用於了不少微生物基因組的高精度從頭組裝、動植物基因組的連續性重構。同時也能夠用了重測序分析，好比得到人類染色體的結構變異圖和分型變異圖。尤爲是這些新技術的應用，填補了在人類參考基因組中存在的序列間隔。此外，讀長的提高在臨牀上也有很重要應用，好比對人類主要組織兼容複合物（HLA）的測序。在宏基因組中，經過長序列測序，可以解決不一樣種羣個體混雜的問題。三代測序還能夠用於轉錄組的研究以及表觀遺傳修飾的研究。總之，相比於二代測序，三代技術帶來的三大特色(‘3C’)：連貫性（contiguity）、完整性（completeness）和準確性（correctness）.

目前有三種商用第三代測序平臺：PacBio的SingleMolecule Real Time(SMRT)測序、Illumina的Tru-seqSynthetic Long-Read測序，和Oxford Nanopore測序。這些測序平臺能夠產生5kbp到15kbp的測序片斷，有些可達100kbp。

固然其中最成熟的仍是PacBio的SMRT，其在2010年開始商用。SMRT也是使用邊合成邊測序的技術，經過熒光標記的鹼基來識別DNA序列。好比PacBio RSII測序平臺，可以測得100kbp讀長，天天產生8GB的數據量。原始測序錯誤在10%-15%，不過經過公式校訂能夠將每一個鹼基的準確率提高到99.99%。不過PacBio的不足時價格比較高，這也限制了其大規模的使用。儘管如此，仍是有很多研究經過PacBio對微生物、真菌、動植物的基因組進行了測序和組裝，也包括人的。

第二個三代測序技術是在2012年由Illumina發明的TruSeq Synthetic  Long Reads，是經過短讀長序列得來的，因此其準確度很是高，錯誤率只有0.1%，於是能夠不用校訂直接用來基因分型分析和組裝。它的缺點是讀長相對於其餘三代測序要短一些，並且容易受到GC偏倚影響。此外，若是是從頭組裝基因組，那麼對短讀長的測序深度可能會達到900X到1500X，這樣最後才能得到30X的長讀長序列。

最新的三代測序技術在2014年，來自Oxford Nanopore。其最新的測序平臺MinION很是小，攜帶很方便。它的測序讀長和PacBio類似。不過它的準確度很低，測序通量也不高，於是它的使用目前主要針對基因組較小的生物，好比大腸桿菌和酵母菌。經過校訂，每一個鹼基的準確性也能提高到99.95%。可是因爲其體積很是小，花費很低，很是適合在偏遠的地方使用，好比在西非爆發埃博拉的地區。

(本人實拍，Nanodrop的MinION測序儀器）

第三代基因圖譜

基因圖譜可以幫助咱們在不瞭解每個鹼基序列的狀況下知道DNA的序列結構。能夠經過分析雜合子標記之間的重組率來重建基因圖譜。但這須要很大的樣本量，對於某些物種來講是很難實現的。二代基因圖譜使用了配對文庫創建。最成功的第三代基因圖譜是在2010年來自BioNano Genomics 的Irys。經過PacBio測序和Irys基因圖譜完成了至今連貫性最好的從頭組裝的人類基因組，contig的N50達到了1.4Mbp，同時在基因組中發現了數百的新的結構變異。在2015年初，Dovetail Genomics經過優化Hi-C的方法發明了cHiCago方法，這種方法使得基因圖譜的構建相對便宜，不過這個方法屬於Dovetail專有，樣本必須寄到他們公司有他們內部完成構建。最新的基因圖譜構建技術來自10XGenomics。它的原理和Illunima的長測序原理類似。

基因組裝：基因組裝最大的障礙來自基因組中的重複序列。二代測序對重複序列，尤爲是比讀長而還長的重複序列的組裝無能爲力。相比之下，三代測序因爲其讀長很長，在對重複序列的組裝中發揮了巨大做用。

長讀長的組裝使用overlapgraph或者stringgraph來完成。IlluminaTru-seq的準確性很高，於是能夠直接用來組裝，而PacBio和MinION的準確性低，由於須要在組裝以前最數據進行校訂。三代測序產生的讀長分佈一般是對數正態分佈。

這種分佈就意味着，大多數讀長是很短的，只有少數讀長可能達到100kbp。因此即使是三代測序技術，保證必定的測序深度對基因組的組裝依然是十分重要的。

結構變異分析：若是是僅僅研究像SNP同樣的很小的變異，二代測序就可以勝任；可是若是要研究很大的結構變異（>50bp），則二代測序的短讀長很難識別變異位點。三代測序的長讀長可以頗有效的識別出結構變異位點。好比經過三代測序技術，在人類基因組中發現了數萬個結構變異，而這些變異一般沒法經過二代測序識別。

基因分型：即將雜合子個體的變異分配到不一樣的單倍體上。基因分型會受到測序錯誤和測序深度偏倚的影響，可能所以引入錯誤的變異類型或者錯失真正的雜合子變異類型。在人類基因組中，雜合子變異在染色體上的距離爲1000bp– 1500bp，這個距離顯然超過了二代測序的讀長，而三代測序則可以很準確的對此進行分型。

第三代測序技術大大提升了基因組的質量，對於大多數基因組<100Mbp的生物，其基因組能夠經過第三代測序進行完美的組裝；對於更大的基因組，如人類和其餘哺乳動物，其基因組的組裝質量也有很大幅度提高。

三代測序的三大特性

連貫性：連貫性對基因組的組裝很是重要，若是連貫性比較好，可以準確的反應出基因結構之間的關係（外顯子、基因簇、轉移元件、調節序列等）。早在1988年就有了Lander-Waterman模型來描述基因的連貫性，估計最低測序深度，而且預測了基於不一樣讀長的contig的平均長度。不過這種預測在測序深度很大的條件下很不許確，好比其預測在100bp讀長100X的測序深度下，能夠組裝成數百GB大小的contig，顯然這已經超多了人類基因組自己的大小。

Lander-Waterman預測不許確的一個緣由是其忽略了基因組中的重複序列。重複序列的大小分佈是按照指數形式遞減的，也就是絕大多數重複序列都是很短的，因此哪怕是測序讀長稍微增長一些，就能解決掉很大一部分從新序列的組裝問題。

完整性：若是一個基因組的測序深度>50X，理論上每個鹼基都會被測到。但實際上，基因組仍然會有不少確實區域，好比即使是最新的人類參考基因組，其中仍然會有超過百萬的「N」。讀長的提高可以有效提升基因組組裝的完整性。

準確性：基因組組裝的準確性能夠在覈酸水平或者結構變異水平進行描述。Illumina的三代測序技術的準確性很是高，每一個鹼基準確性>99.9%，PacBio和Nanopore的準確性在足夠測序深度的狀況下，通過算法校訂以後也可以達到99.9%。對於PacBio測序而言，其準確性主要是受到隨機的插入缺失突變的影響。而Nanopore的準確性會受到一些非隨機因素的影響，好比共聚物序列，於是其準確性要落後於PacBio。在基因組結構水平上的準確性主要受重複序列的影響。重複序列可能會被認爲是同一個序列區域。長讀長測序可以減小這種錯誤，3.6kbp的讀長與150kbp的讀長相比，組裝錯誤多了10倍。

總結

三代測序技術極大的提高了基因組的質量。雖說20X的測序可以對一個基因組的組裝已經足夠了，可是仍是建議>75X，這樣有足夠的測序深度可以對三代測序中的錯誤進行有效的校訂。若是預算和樣本容許，建議只對校訂後深度>20X，長度>20kbp的測序片斷進行組裝。同時，測序技術發展十分迅速，在將來咱們能夠有更高質量的基因組，更低的花費。

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參考資料：

Lee, H., Gurtowski, J., Yoo, S., Nattestad, M., Marcus, S., Goodwin, S., ... & Schatz, M. (2016). Third-generation sequencing and the future of genomics. BioRxiv, 048603.

Bellec, A., Courtial, A., Cauet, S., Rodde, N., & Vautrin, S. (2016). Long Read Sequencing Technology to Solve Complex Genomic Regions Assembly in Plants. Next Generat Sequenc & Applic, 3(128), 10-4172.